调味品杂志（月刊） 2018年7期
1-5
出版日期：2018-07-01
ISSN:1000-9973
CN:23-1299/TS
蜗牛酶辅助提取石榴皮原花青素的响应面优化
原花青素是一类黄烷醇单体及其聚合体的多酚类化合物，又称聚黄烷醇类多酚，前者为黄烷-4-醇或黄烷-3,4-二醇，后者则为缩合单宁和酚酸，广泛存在于各类植物中[1]，且存在于日常生活的许多食品中，如红酒等。许多食源性的原花青素在日常生活中被人们摄取，且具有较好的生物活性，原花青素具有抗氧化、清除自由基、防治心血管疾病、抗炎、防癌抗癌等功能[2-6]。目前，原花青素在食品、药品、保健食品等领域应用广泛，作为天然食源性防腐剂，主要用于延长食品的保质期，可消除人工合成防腐剂带来的安全风险，并对人体健康具有重要作用；作为食品调料，广泛用于各种日常食品：如奶酪、蛋糕等，以及饮料、酒中，可提升食品的营养保健功能。新鲜石榴皮中黄酮含量较高约为6%，原花青素为其主要的黄酮化合物成分[7,8]，合理利用可变废为宝，故其分离纯化技术也越来越受到重视。
目前，植物中原花青素提取工艺主要有传统溶剂提取法[9]、微波和超声波辅助法[10]、酶法辅助提取[11]等，酶法提取利用酶对植物细胞壁进行降解和破坏，可增加细胞内容物的溶出，提高有效成分的提取效率。本试验采用蜗牛酶辅助从石榴皮中提取原花青素，并通过BBD设计实验优化其工艺条件，将会给石榴皮综合利用提供新的依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
石榴（购于当地超市，产地泰州）；蜗牛酶（破壁率可达90%以上）及其它生化试剂（上海金穗生物科技有限公司）；其它实验试剂均为市售分析纯。
pHS-3C酸度计 上海精密科学仪器有限公司；RE-52旋转蒸发仪 上海研承仪器有限公司）；SHB-Ⅲ真空泵 郑州长城仪器有限公司；DHG-9202-3SA电热鼓风干燥箱 上海三发科学仪器有限公司）；XFB-200微型高速粉碎机 湖南吉首中诚制药机械厂；UV754N紫外-可见分光光度计 上海精科仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 石榴皮预处理
将新鲜石榴洗干净、手工剥皮，将石榴皮放入烘箱中，设定温度60 ℃、烘干12 h。取出之后用微型高速粉碎机粉碎[12]，过40目筛子，所得粉末状经50~70 ℃的烘箱中干燥，粉末密封保存在白色塑料袋里备用。
1.2.2 标准曲线的绘制
本试验采用正丁醇-盐酸法测定原花青素的含量，参考文献[13]，记录试验数据并绘制出原花青素标准曲线。
1.2.3原花青素的提取
参考文献[14]，称取一定量的备用石榴皮粉末置于圆底烧瓶中，在一定的酶用量( wt%，下同) 下，加入一定pH的醋酸-醋酸钠缓冲溶液、摇匀，于水浴锅中加热搅拌一定时间后趁热过滤、收集滤液。回收滤渣并加入100 mL70%乙醇，80 ℃条件下提取30 min后趁热过滤，分离并保留滤液，所得滤渣重复上一次操作，合并所有滤液并再次过滤、收集滤液，滤液经旋转蒸发后（50 ℃），得到原花青素浓缩液。用甲醇将其定容至50 mL容量瓶中，在3500转下离心10 min，移取1mL上层清液按照原花青素标准曲线绘制方法测定其吸光度值，记录并处理实验数据。
1.2.4 原花青素得率的计算
得率（%）=[( C×V) /M]×10-3×100% 。
式中：V: 浓缩液定容后的体积（mL）；C: 浓缩液中原花青素的含量（mg/mL）; M: 石榴皮粉末质量（g）。根据原花青素含量与吸光度值之间的一元线性回归方程可得出原花青素的含量，进而计算出得率。
1.2.5 单因素试验
在固定其他因素相同的条件下，分别考察各单因素：酶用量(%)、提取时间(min)、提取温度(℃)和 pH值对得率的影响。
1.2.6 响应曲面法优化原花青素提取条件
以酶用量(w%)、提取时间(min)、提取温度(℃)和 pH值为单因素试验考察变量，依据BBD试验设计原理，以原花青素得率为优化响应值，采用四因素三水平的响应面分析法优化提取条件，因素水平安排见表1。
表1 响应面试验因素及水平
因素 水平
-1 0 1
A提取温度/℃ 45 50 55
B酶用量/% 0.8 1.0 1.2
C提取时间/min 75 90 105
D pH值 4.5 5.0 5.5
2 结果与分析
2.1 原花青素标准曲线的绘制
以吸光度（A550）为纵坐标，原花青素浓度（C）为横坐标，绘制曲线。由图1可知，原花青素的浓度与吸光度值之间的一元线性回归方程为：，R2= 0.9993。结果表明，采用1.2.2的方法测得的原青花素浓度，其在30～300 μg/mL浓度范围内具有较好的线性关系。
2.2 单因素试验
准确称取备用的石榴皮粉末3. 000 g进行下列单因素试验。
2.2.1 酶用量对得率的影响
提取温度为50 ℃，pH值为5.0，提取时间为90 min，结果见图2。由图2可知，随着酶用量的增多，原花青素得率也逐渐增大，当酶用量为1.0%时得率最大；随后原花青素的得率随着酶用量增加而下降。其原因可能是酶用量较低时，酶与底物结合较充分，细胞壁与细胞间的果胶物质水解程度大、进而溶出原花青素。当酶用量大于1.0%时，底物浓度不能使酶达到饱和，从而抑制酶水解果胶成分使原花青素的提取效果下降[15]。因此，酶用量为1.0%为宜。
2.2.2 pH值对得率的影响
提取温度为50 ℃，酶用量1.0%，提取时间为90 min，结果见图3。由图3可知，随着缓冲液pH值升高原花青素得率也升高；pH值为5.0时得率最大，pH值过高得率反而下降。其原因可能是pH值过高蜗牛酶的生物活性受到一定抑制作用，不利于提取。因此，本试验pH值5.0左右为宜。
2.2.3 提取温度对得率的影响
pH值5.0，酶用量1.0%，提取时间为90 min，结果见图4。由图4可知，温度小于50 ℃时，，原花青素得率随着温度的升高而增大，50 ℃时得率达到最大值，继续升高温度后呈现下降趋势。其原因可能是在50 ℃前随着温度的升高果胶物质水解程度增大、反应速率较快，使酶水解反应较强，原花青素得率不断增加；温度超过50℃时维系酶空间结构的非共价键断裂，部分蜗牛酶失去活性，水解程度降低、得率下降。因此，提取温度50 ℃为宜。
2.2.4 提取时间对得率的影响
pH值5.0，酶用量1.0%，提取温度为50 ℃，结果见图5。由图5可知，随着提取时间的延长，原花青素得率呈现上升趋势，达到90 min时达到最大，继续延长提取时间得率不升反降。这可能是由于原花青素属于多酚类化合物，延长提取时间会使原花青素的稳定性下降、原花青素得率进而下降。因此，提取时间90 min为宜。
2.3 响应面分析试验
2.3.1 试验设计及结果
根据单因素试验结果，试验设计及结果见表2。通过Design Expert软件，建立以原花青素得率为响应值的回归模型：
Y=0.64+0.07A+0.038B+5.417×10-3C+0.048D+0.044AB+0.031AC-0.021AD-0.021BC-0.063BD+0.069CD-0.083A2-0.083B2-0.12C2-0.019D2 。 （2）
表2响应面试验设计及结果
试验号 A B C D 原花青素得率Y/%
1 0 -1 0 1 0.614
2 -1 0 0 -1 0.368
3 0 0 0 0 0.647
4 0 0 0 0 0.651
5 0 0 -1 -1 0.529
6 0 0 1 -1 0.394
7 1 0 -1 0 0.446
8 0 -1 -1 0 0.395
9 0 1 -1 0 0.484
10 -1 0 -1 0 0.384
11 -1 -1 0 0 0.421
12 0 0 0 0 0.628
13 0 1 1 0 0.411
14 0 0 0 0 0.658
15 1 0 1 0 0.578
16 0 -1 0 -1 0.381
17 -1 0 0 1 0.514
18 1 -1 0 0 0.466
19 0 0 0 0 0.643
20 0 1 0 1 0.612
21 0 -1 1 0 0.395
22 0 1 0 -1 0.622
23 -1 1 0 0 0.386
24 1 0 0 -1 0.574
25 1 1 0 0 0.608
26 0 0 -1 1 0.456
27 -1 0 1 0 0.393
28 0 0 1 1 0.598
29 1 0 0 1 0.634
2.3.2 响应面优化结果分析
BBD试验设计回归模型分析结果见表3。
表3回归模型结果分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性
模型 0.3 14 0.021 14.99 ＜0.0001 **
A 0.059 1 0.059 41.6 ＜0.0001 **
B 0.017 1 0.017 11.99 0.0038 **
C 3.521×10-4 1 3.521×10-4 0.25 0.6255
D 0.027 1 0.027 19.15 0.0006 **
AB 7.832×10-3 1 7.832×10-3 5.54 0.0337 *
AC 3.782×10-3 1 3.782×10-3 2.68 0.1242
AD 1.849×10-3 1 1.849×10-3 1.31 0.2719
BC 1.722×10-3 1 1.722×10-3 1.22 0.2883
BD 0.016 1 0.016 11.32 0.0046 **
CD 0.019 1 0.019 13.57 0.0025 **
A2 0.045 1 0.045 31.86 ＜0.0001 **
B2 0.046 1 0.046 31.57 ＜0.0001 **
C2 0.1 1 0.1 69.65 ＜0.0001 **
D2 2.36×10-3 1 2.36×10-3 1.67 0.2172
残差 0.02 14 1.414×10-3
失拟项 0.016 10 1.642×10-3 1.95 0.2714
纯误差 3.365×10-3 4 8.413×10-4
总值 0.32 28
注：**差异极显著p＜0.01； *差异显著 0.01＜p＜0.05；差异不显著p>0.05。
由表3可知，模型的p＜0.0001，说明式中回归方差的关系是显著的；失拟项的p值为0.2714>0.05，说明所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，式中回归方程的关系是好的；其R2= 0.9374，表明此模型拟合度较好；回归模型一次项A，B，D对原花青素得率影响极显著，一次项C影响不显著，；二次项BD，CD，A2，B2，C2影响极显著、交互项AB影响显著，其余不显著，说明各因素对响应值的影响比较复杂，并非简单的线性关系，各因素对原花青素得率的影响次序为：A>D>B>C。
响应曲面图见图6～11。由6~11图可知，响应中心位于所考察区域内，且响应曲面坡度越陡，则响应值对试验条件的改变越敏感，说明在考察区域范围内存在最大响应值（刘奉强等，2011）。试验设计条件下得出原花青素提取最佳工艺为：pH值5.0、提取温度51.58 ℃、酶用量0.982%、提取时间95.19 min，原花青素得率为0.692%。考虑到实际操作条件，在如下条件下进行3次平行试验：提取温度50 ℃、pH值5.0、提取时间90 min、酶用量1.0%，原花青素得率为0.658%。
图6 Y=(A,B)的响应图面 图7 Y=(A,C)的响应图面
图8 Y=(A,D)的响应图面 图9 Y=(B,C)的响应图面
图10 Y=(B,D)的响应图面 图11 Y=(C,D)的响应图面
3 结论
本试验采用蜗牛酶辅助提取石榴皮中的原花青素，在单因素试验基础上采用响应曲面法优化提取工艺。试验结果表明，采用响应曲面法优化所得到的实验模型拟合度良好，具有一定的实际应用和研究参考价值，结合试验实际操作条件其响应面优化的提取工艺参数为：酶解温度50 ℃、pH值5.0、提取时间90 min、酶解浓度1.0%，原花青素得率为0.658%。